【正文】近年来，随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用，器官移植、导管插管等普遍开展，深部真菌感染率越来越高。引起深部真菌感染的病原菌主要有白色念珠苗、曲菌和隐球菌等。传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培养耗时长，阳性率较低，组织活检缺乏典型改变，影响早期及正确诊断。近年来，用于检测真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和特异性基因片段的分子生物学检测已成为这一领域研究的热点。 
　　一、 真菌胞壁或胞内成分的检测
　　1、 烯醇化酶（Enolase）  烯醇化酶又称2—磷酸—I>甘油盐水解酶或弹力酶，是糖酵解所必需的胞内酶。烯醇化酶广泛存在于真菌细胞中，含量丰富且高度保守。它也是白色念珠菌中含量最为丰富的蛋白质之一，研究显示只有在深部白色念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄生在浅表部位的白色念殊菌一般不会释放该酶。Walsh等采用白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体检测血标本中的白色念珠菌烯醇化酶以确定是否有深部真菌感染，并以组织活检和血培养加以对照。在组织活检或血培养中阳性的24例肿瘤患者中,抗原阳性18例,146例组织活检或血培养阴性的肿瘤患者中,抗原阳性6例。敏感性和特异性分别为75%和96%[1]。由于烯醇化酶在体内具有很强的抗原性，形成免疫复合物在体内迅速清除，使检测敏感率受到影响。有学者建议检测血清中抗烯醇化酶抗体及抗体滴度的动态变化来诊断深部念珠菌病．但因寄殖者也可检测到抗体，免疫缺陷者常缺乏抗体，故抗体检测仅有补充诊断价值。
　　二、 分子生物学方法
　　深部真菌的血清免疫学鉴定方法尽管有了很大发展,但仍存在耗时长、敏感性低的问题。近年来,研究者了大量工作,试图应用分子生物学方法鉴定医学重要真菌弥补传统方法的不足。作为分子生物学方法，必须具备以下几个条件：A、选择最适当的靶基因，满足商用试剂盒的检测。B、适当提取真菌DNA的方法。C、最适合常规实验室开展。
　　1、样本处理：DNA样本的制备对真菌检测至关重要。一份理想的样本应为不含蛋白质残渣、污染物、DNA抑制剂，并具有较高的浓度。虽然目前已有多种真菌DNA提取和纯化试剂盒问世，但没有一种能被普遍采用的最佳产品。另外，标本的来源也与检测结果有关。一项研究显示，血培养阴性的侵袭性念珠菌感染的血清较全血标本的PCR检出率高（27%vs7%）。
　　2、靶基因的选择：深部真菌的靶基因包括单拷贝、多拷贝细胞核基因和线粒体基因及RNA。一般而言，多拷贝基因的检测灵敏度高于单拷贝基因。多拷贝线粒体基因已广泛用于白色念珠菌和各种曲霉菌的PCR检测。核糖体基因包括存在于所有真菌的高度保守序列如18S、28S rDNA或rRNA和高度可变的内部转录间隔区(ＩＴＳ)，前者可用于筛选真菌感染，后者则用于菌种的确定。各种真菌的靶基因见表2。
　　3、Southern杂交　在ＰＣＲ扩增的片段中设计种特异性探针,用同位素或生物素进行标记,与事先转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上的ＰＣＲ产物杂交,可鉴定到种,其敏感性比电泳提高一个数量级。由于Southern杂交存在操作繁琐、耗时长等缺点，此方法更适用于研究,而不宜作为实验室检测真菌的常规方法。
　　4）、特异性寡核苷酸探针斑点(狭缝)杂交　斑点(狭缝)杂交可分为正向杂交和反向杂交。前者是将ＰＣＲ产物固定到膜上,然后用放射性或非放射性标记的探针与膜上的ＰＣＲ产物杂交,最后通过一定的检测手段得到杂交信号。而后者则是将探针经加尾后固定于膜上,将已标记的ＰＣＲ产物与膜上的探针进行杂交。因为反向杂交可将多种探针同时固定于同一张膜上,这样可以一次检测多种真菌,省时省力,具有很好的应用前景。Posteraro等设计一对通用引物扩增ERG11基因,针对此基因中的靶序列设计10种寡核苷酸探针,通过一个点杂交装备将加尾后的探针点在膜上,经固定后与标记有生物素的ＰＣＲ产物杂交,可将10种临床常见真菌直接鉴定到种水平。
　　5）、PCR-ELISA微孔板杂交法　近年来,ＥＬＩＳＡ利用酶促反应催化底物显色用于检测ＰＣＲ扩增产物。微孔板杂交与膜杂交相比有以下优点:①易操作;②漂洗时间短,节省时间;③本底低,也不需要封闭过程;④固定DNA也不需要加热或紫外线照射。此方法在定性和定量分析上均有较高的敏感性和稳定性。Loffler等用链亲和素将微孔板包被,生物素标记的探针通过生物素＿亲和素作用而固定于微孔板。然后,地高辛标记的ＰＣＲ扩增产物变性后与微孔板上固定的探针杂交,再加入抗地高辛＿过氧化物酶,经显色后读取Ｄ值。
　　虽然分子生物学方法为深部真菌的检测提供了更敏感、特异的方法，某些技术问题如外来DNA的污染，有效地区分寄植和感染等还有待解决，另外，这些检测结果仍不能指导临床何时开始及停止抗真菌治疗，不宜作为疗效考核的指标。 
　　三、 真菌代谢产物的检测 
　　在感染或寄殖宿主体液或组织中检测真菌特异性代谢物为一种完全不同的诊断方法。研究显示，念珠菌属的代谢产物D-arabinitol可作为侵袭性念珠菌病的诊断标志，在患者的血液和尿液中均可检出。D-arabinitol检测受以下几个因素的影响：1、临床念珠菌感染株何时在血液产生足够的D-arabinitol尚不清楚。2、肾功能不全者对血清D-arabinitol的浓度影响如何？3、血清中的D-arabinitol是来源于宿主还是念珠菌？4、寄殖性念珠菌是否也致宿主血清D-arabinitol升高？由于上述原因，使D-arabinitol检测的临床应用受到限制。
　　近年深部真菌感染的诊断水平得到了较大发展，新技术为早期诊断提供了有力帮助。但是，这些新技术往往需要完善的实验室条件，干扰因素多，操作步骤较烦琐，不利于普遍开展；并且检测结果仍不能作为临床疗效考核的金标准。若将传统检测方法如真菌培养与新技术相结合，更有利于深部真菌感染诊断水平的提高。
　　四、PCR产物的分析        
　　1）、　琼脂糖凝胶电泳　将ＰＣＲ扩增产物在含有溴化乙啶(ＥＢ)的琼脂糖凝胶中电泳,ＤＮＡ被溴化乙啶染色,在紫外(一般302ｎｍ)条件下可观察到特异性的荧光条带，此为最常见的分析方法。
　　2）、限制性酶切分析　限制性酶切分析是用某种限制性内切酶消化ＰＣＲ扩增产物后再进行电泳,由于各扩增产物的ＤＮＡ序列不同,限制性内切酶针对特定位点进行消化后,便有其特定消化片段,观察消化片段的数目及大小,从而可以在种间分型或加以鉴别。Morace等根据细胞色素Ｐ450L1A1设计的念珠菌通用引物扩增8种重要真菌后,利用3种限制性内切酶对产物进行消化,其中白念珠菌经3种酶消化后,分别得到343ｂｐ,300ｂｐ和50ｂｐ,243ｂｐ以及107ｂｐ3组特异性片段,根据得到的各个菌特异性消化片段可以将临床常见真菌鉴定到种水平。
　　3）、Southern杂交　在ＰＣＲ扩增的片段中设计种特异性探针,用同位素或生物素进行标记,与事先转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上的ＰＣＲ产物杂交,可鉴定到种,其敏感性比电泳提高一个数量级。由于Southern杂交存在操作繁琐、耗时长等缺点，此方法更适用于研究,而不宜作为实验室检测真菌的常规方法。
　　4）、特异性寡核苷酸探针斑点(狭缝)杂交　斑点(狭缝)杂交可分为正向杂交和反向杂交。前者是将ＰＣＲ产物固定到膜上,然后用放射性或非放射性标记的探针与膜上的ＰＣＲ产物杂交,最后通过一定的检测手段得到杂交信号。而后者则是将探针经加尾后固定于膜上,将已标记的ＰＣＲ产物与膜上的探针进行杂交。因为反向杂交可将多种探针同时固定于同一张膜上,这样可以一次检测多种真菌,省时省力,具有很好的应用前景。
　　5)、液相杂交　设计全真菌的通用引物,扩增了包括6种念珠菌和2种曲霉菌在内的8种常见的真菌病原体。然后与固定在聚苯乙烯小珠上的种特异性探针杂交,将小珠上探针捕获的特定ＰＣＲ产物洗脱后,根据其序列进行鉴定。
　　6）、PCR-ELISA微孔板杂交法　近年来,ＥＬＩＳＡ利用酶促反应催化底物显色用于检测ＰＣＲ扩增产物。微孔板杂交与膜杂交相比有以下优点:①易操作;②漂洗时间短,节省时间;③本底低,也不需要封闭过程;④固定DNA也不需要加热或紫外线照射。此方法在定性和定量分析上均有较高的敏感性和稳定性。Loffler等用链亲和素将微孔板包被,生物素标记的探针通过生物素＿亲和素作用而固定于微孔板。然后,地高辛标记的ＰＣＲ扩增产物变性后与微孔板上固定的探针杂交,再加入抗地高辛＿过氧化物酶,经显色后读取Ｄ值。还有学者等用微孔板杂交法快速、定量地检测ＰＣＲ扩增产物,并与电泳法和Southern杂交法比较,结果表明微孔板杂交法与Southern杂交法相同,但微孔板杂交法可在1ｄ获得结果,而Southern杂交法需2～3ｄ的时间。
　　虽然分子生物学方法为深部真菌的检测提供了更敏感、特异的方法，某些技术问题如外来DNA的污染，有效地区分寄植和感染等还有待解决，另外，这些检测结果仍不能指导临床何时开始及停止抗真菌治疗，不宜作为疗效考核的指标。